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    Percoll細胞分離液的使用方法

    發布時間:2015-06-24   點擊次數:4722次

    實驗原理


    Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20mosm/kg HO),粘度也很小,可形成高達1.3g/mL密度,采用預先形成的密度梯度時可在低離心力(200~1000g)于數分至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。由于Percoll擴散常數低,所形成的梯度十分穩定。此外,Percoll不穿透生物膜,對細胞無毒害,因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒,還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。

    實驗試劑


    1. 小牛血清

    2. Percoll細胞分離液

    3. 8.5%NaCl

    4. 1.5MPBS

    實驗設備


    1. 高速冷凍離心機(3K-30)

    2. 4℃、-20℃冰箱

    3. 長針頭注射器

    4. 1.5mL和10mL離心管


    實驗材料


    PBMC細胞

    實驗步驟


    1. 不同濃度(密度)Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5% NaCl或1.5M PBS混合達到生理性滲透壓,然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀釋到所需濃度。

    2. 不連續密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤,除去多余血清,這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下,使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置,有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時,可將Percoll液放入注射器中,小針頭斜面緊貼管壁,任其自然慢慢流下。

    3. 裝樣:樣品體積和細胞濃度根據不同細胞而異,一般加樣體積不宜過大,細胞濃度也不可過高,否則會影響細胞的分離和回收。

    4. 離心:一般采用離心力為400g,時間20~25min。由于多層Percoll之間密度差別不大,因此離心機加速、降速時要慢,要平穩。

    5. 取樣:當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時,可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2次洗滌后可供培養或檢測用。

    舉例:

    1. 富含NK活性大顆粒淋巴細胞(LGL)的純化:按順序由下向上逐層加50%、47.5%、45%、42.5%和40%五種不同密度的Percoll,如用10mL試管(或塑料管)分離,每層Percoll約1.2~1.5mL,初步從外周血中分離的PBMC細胞1×108懸于1mL培基中,按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5%與45%Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。

    2. 純化淋巴母細胞和除去死細胞:分別疊加50%和30%Percoll液。收取經PHA(或其它抗原、有絲分裂原)刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC(如腎綜合征出血熱患者),按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細胞為小淋巴細胞;兩層Percoll之間為淋巴母細胞,純度和回收率在80%以上,位于30%Percoll表面是死細胞。收獲淋巴母細胞可進行表型、結構以及功能的研究。

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